微囊化软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞的体外定向分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (30): 4790-4796.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.006

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

微囊化软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞的体外定向分化

张瑾¹，张子琦²，张滟¹，许珉¹

西安交通大学第二附属医院，¹耳鼻咽喉头颈外科病院，²骨科，陕西省西安市 710004

修回日期:2014-06-26 出版日期:2014-07-16 发布日期:2014-08-08
通讯作者: 许珉，主任医师，博士生导师，西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院，陕西省西安市 710004
作者简介:张瑾，女，1983年生，汉族，西安交通大学在读博士，医师，主要从事中耳炎，耳鼻咽喉头颈外科研究。
基金资助:
本项目由“中央高校基本科研业务费专项资金”资助(0817-08143017)

The inductive effect of microcapsuled chondrocytes cocultured with bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Jin¹, Zhang Zi-qi², Zhang Yan¹, Xu Min¹

¹Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China; ²Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China

Revised:2014-06-26 Online:2014-07-16 Published:2014-08-08
Contact: Xu Min, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Zhang Jin, Studying for doctorate, Physician, Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
Supported by:
Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 0817-08143017

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往诱导骨髓间充质干细胞定向分化的直接接触共培养法、Transwell膜非接触共培养诱导法存在干细胞纯度低、增殖缓慢等不足。
目的：对比分析微囊化共培养体系与传统Transwell共培养体系对骨髓间充质干细胞的诱导效果。
方法：实验组取第3代兔骨髓间充质干细胞与微囊化的第2代兔关节软骨细胞，按1∶1的比例在Transwell小室进行共培养，同时设置第3代兔骨髓间充质干细胞与第2代兔关节软骨细胞共培养于Transwell小室的传统共培养组，以及纯干细胞培养组。MTT法对比3组干细胞的增殖率，甲苯胺蓝染色、番红花O染色观察软骨基质的合成，阿利新蓝染色法和Elisa法定量测量糖胺聚糖与Ⅱ型胶原蛋白的合成。
结果与结论：传统共培养组细胞增殖率低于实验组与纯干细胞培养组(P < 0.05)。实验组细胞糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平高于传统共培养组、纯干细胞培养组(P < 0.05)，甲苯胺蓝染色、番红花O染色强度强于传统共培养组、纯干细胞培养组。表明微囊化的软骨细胞能够成功诱导骨髓间充质干细胞向成软骨方向定向分化，且诱导效果优于传统的Transwell膜分离共培养法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 微囊, 骨髓间充质干细胞, 软骨细胞, 共培养, 诱导分化

Abstract:

BACKGROUND: Traditional coculture methods for directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, such as direct contact method and Transwell coculture system, appear to have low purity and slow proliferation.
OBJECTIVE: To compare the inductive effect of microcapsule coculture system and traditional transwell coculture system on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The passage 2 microcapsuled chondrocytes and the passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells harvested from rabbits were co-cultured at a ratio of 1:1 in a Transwell chamber. Another passage 2 chondrocytes and passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured using traditional transwell coculture system. Pure bone marrow mesenchymal stem cells were served as controls. MTT assay was used to compare cell proliferation, toluidine blue staining and safranine O staining were used for observation of cartilage matrix synthesis, alcian blue staining and ELISA test were used to measure glycosaminoglycans and synthesis of type II collagen, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the traditional co-culture method, the microcapsule coculture system and pure culture method showed better cell proliferation (P < 0.05). The levels of glycosaminoglycans and type II collagen were higher in the microcapsule coculture group than the traditional coculture group and pure culture group (P < 0.05). Moreover, the microcapsule coculture group showed better outcomes in toluidine blue staining and safranine O staining than the traditional coculture group and pure culture group. These findings indicate that the microcapsule coculture system is more effective in the induction of bone marrow mesenchymal stem cells than traditional Transwell coculture system.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: bone marrow, stem cells, chondrocytes

中图分类号:

张瑾，张子琦，张滟，许珉. 微囊化软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞的体外定向分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(30): 4790-4796.

Zhang Jin, Zhang Zi-qi, Zhang Yan, Xu Min. The inductive effect of microcapsuled chondrocytes cocultured with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(30): 4790-4796.

图/表（结果） 3

2.1 BMSCs的分离培养及鉴定结果 在分离48 h后，首次换液时可见培养液中悬浮有大量圆形、无核、不贴壁的小细胞，即血液中的杂质细胞，瓶底有BMSCs零散分布，呈圆形、椭圆形或棱形，大小不一，视野中可见一黑色不透光的椭圆形骨髓颗粒(图1A)。细胞传至2代，培养至100%融合时，可见BMSCs呈椭圆形或长棱形，形态规则，大小均一，仍可见一定数量圆形无核的小杂质，视野中可见BMSCs高度密集形成骨化中心，其外周细胞呈螺旋状或同心圆状排列，符合2代BMSCs的生物学特点(图1B)。传至3代的BMSCs呈椭圆形或长棱形，形态规则，大小均一，表现出良好的折光性，且杂质细胞数量明显减少(图1C)。3代BMSCs的苏木精-伊红染色可见细胞形态呈椭圆形或长棱形，形态规则，大小均一，蓝色的细胞核与粉色的胞浆，着色良好(图1D)。

流式细胞术结果显示，细胞中CD44和CD105的阳性率均大于90%，CD34和CD45的阳性率均小于2%，其符合BMSCs的表面标记物特征，且纯度满足下游实验需要(图2)。

2.2 MTT法检测细胞增殖结果 经单因素方差分析结果显示，在共培养的1，4，7 d，传统共培养组中干细胞增殖率低于实验组和纯干细胞组(P < 0.05)，而实验组与纯干细胞组细胞增殖率比较差异无显著性意义(P ≥ 0.05)，见图3。

2.3 甲苯胺蓝染色结果 实验组甲苯胺蓝染色致密、均匀，充满整个视野；而传统共培养组染色则较为稀疏，且分布不均匀；纯干细胞组染色呈阴性或弱阳性，见图4。

2.4 番红花O染色结果 实验组番红花O染色强度远远强于传统共培养组，且分布均匀、致密，充满整个视野；纯干细胞组染色呈阴性或弱阳性，见图5。

2.5 糖胺聚糖检测结果 实验组为(0.184±0.006) mg，传统共培养组为(0.151±0.011) mg，纯干细胞组为(0.063± 0.002) mg。经单因素方差分析结果显示，实验组糖氨聚糖合成量高于传统共培养组和纯干细胞组(P < 0.05)，见图6A。

2.6 Elisa定量检测Ⅱ型胶原蛋白结果 实验组、传统共培养组及纯干细胞组培养液中Ⅱ型胶原蛋白质量浓度分别为(23.57±2.46)，(15.14±2.31)，(9.17±1.23) μg/L。实验组细胞培养液中Ⅱ型胶原蛋白水平显著高于传统共培养组和纯干细胞组(P < 0.05)，见图6B。

参考文献

[1] Kang N,Liu X,Guan Y,et al.Effects of co-culturing BMSCs and auricular chondrocytes on the elastic modulus and hypertrophy of tissue engineered cartilage. Biomaterials.2012; 33(18):4535-4544.
[2] Zhang L,He A,Yin Z,et al.Regeneration of human-ear-shaped cartilage by co-culturing human microtia chondrocytes with BMSCs.Biomaterials.2014;35(18):4878-4887.
[3] Fahy N,Farrell E,Ritter T,et al.Immune Modulation to Improve Tissue Engineering Outcomes for Cartilage Repair in the Osteoarthritic Joint.Tissue Eng Part B Rev.2014[Epub ahead of print].
[4] Yang Z,Zhu L,Li F,et al.Bone marrow stromal cells as a therapeutic treatment for ischemic stroke.Neurosci Bull. 2014; 30(3):524-534.
[5] Ye ZL,Hou XX,Chen RL,et al.Effects of methylthiouracil on the proliferation and apoptosis of rat bone marrow stromal cells. Exp Ther Med.2014;7(6):1738-1744.
[6] Zheng L,Yang J,Fan H,et al.Material-induced chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells is material- dependent. Exp Ther Med.2014;7(5):1147-1150.
[7] Geiger F,Beverungen M,Lorenz H,et al.Bone Substitute Effect on Vascularization and Bone Remodeling after Application of phVEGF165 Transfected BMSC.J Funct Biomater. 2012; 3(2): 313-326.
[8] 刘洋,于滨滨,王为,等.微囊化共培养诱导骨髓间充质干细胞体外定向成骨分化研究[J].高校化学工程学报,2010,24(6):993- 999.
[9] Lim F,Sun AM.Microencampsulated islet as bioartifical endocrine pancreas. Science.1980;210(4472):908-910.
[10] De Vos P,van Hoogmoed CG,van Zanten J,et al.Long-term biocompatibility, chemistry, and function of microencapsulated pancreatic islets.Biomaterials.2003;24(2):305-312.
[11] Yoshioka Y,Suzuki R,Oka H,et al.A novel cytomedical vehicle capable of protecting cells against complement.Biochem Biophys Res Commun.2003;305(2):353-358.
[12] Hasse C,Schrezenmeir J,Stinner B,et al.Successful allotransplantation of microencapsulated parathyroids in rats.World J Surg.1994;18:630-634.
[13] Gomez N,Balladur P,Calmus Y,et al.Evidence for survival and metabolic activity of encapsulated xenogeneic hepatocyts transplanted without immunosuppression in Gunn rats. Transplantation.1997;63(12):1718-1723.
[14] Aebischer P,Tresco PA,Sagen J,et al.Transplantation of microcapsulated bovine chromaff in cells reduces lesiorr induced rotational asymmetry in rats. Brain Res.1991;560: 43-49.
[15] Inaba K,Zhou D,Yang B,et al.Normalization of diabetes by xenotransplantation of cryopreserved microencapsulated pancreatic islets. Application of a new strategy in islet banking. Transplantation.1996;61(2):175-179.
[16] Hang H,Shi X,Wu Y,et al.In vitro analysis of cryopreserved alginate-poly-L-lysine-alginate-microencapsulated human hepatocytes.Liver Int.2010;30(4):611-622.
[17] 张晨,王坤正,强辉,等.兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究[J].西安交通大学学报:医学版,2010,31(2):138-142.
[18] Craft AM,Ahmed N,Rockel JS,et al.Specification of chondrocytes and cartilage tissues from embryonic stem cells.Development.2013;140(12):2597-2610.
[19] Cheverud JM,Lawson HA,Bouckaert K,et al.Fine-mapping quantitative trait loci affecting murine external ear tissue regeneration in the LG/J by SM/J advanced intercross line. Heredity (Edinb).2014 ;112(5):508-518.
[20] Strong AL,Jiang Q,Zhang Q,et al.Design, synthesis, and osteogenic activity of daidzein analogs on human mesenchymal stem cells. ACS Med Chem Lett. 2013;5(2): 143-148.
[21] Calloni R,Cordero EA,Henriques JA,et al.Reviewing and updating the major molecular markers for stem cells.Stem Cells Dev.2013;22(9):1455-1476.
[22] Nagamoto Y,Tashiro K,Takayama K,et al.The promotion of hepatic maturation of human pluripotent stem cells in 3D co-culture using type I collagen and Swiss 3T3 cell sheets. Biomaterials.2012;33(18):4526-4534.
[23] Xing Y,Lv A,Wang L,et al.The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Mol Cell Biochem. 2012;360(1-2):279-287.
[24] Tomaro-Duchesneau C1,Saha S,Malhotra M,et al.Probiotic Ferulic Acid Esterase Active Lactobacillus fermentum NCIMB 5221 APA Microcapsules for Oral Delivery: Preparation and in Vitro Characterization.Pharmaceuticals (Basel). 2012;5(2): 236-248.
[25] Schneider S,Klein HH.Long-term graft function of cryostored alginate encapsulated rat islets.Eur J Med Res.2011;16(9): 396-400.
[26] Park SJ,Shin S,Koo OJ,et al.Functional improvement of porcine neonatal pancreatic cell clusters via conformal encapsulation using an air-driven encapsulator.Exp Mol Med.2012;44(1):20-25.
[27] Zhang Y,Wang W,Xie Y,et al.Optimization of microencapsulated recombinant CHO cell growth, endostatin production, and stability of microcapsule in vivo.J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater.2008;84(1):79-88.
[28] 刘洋,刘天庆,范秀波,等.旋转壁式生物反应器中微囊化骨髓间充质干细胞支持造血干/祖细胞的体外扩增[J].高校化学工程学报, 2008,22(3):471-477.
[29] Vériter S,Mergen J,Goebbels RM,et al.In vivo selection of biocompatible alginates for islet encapsulation and subcutaneous transplantation.Tissue Eng Part A.2010;16(5): 1503-1513.
[30] Kerby A,Bohman S,Westberg H,et al.Immunoisolation of islets in high guluronic acid barium-alginate microcapsules does not improve graft outcome at the subcutaneous site.Artif Organs.2012;36(6):564-570.

引言

耳郭软骨的再生非常缓慢，一旦缺损不能有效修复^[1]。近年来细胞工程技术的发展为解决该难题提供了新的思路，其核心技术是构建类软骨细胞-细胞支架复合体来实现耳郭软骨的再生^[2]。然而，软骨细胞由于来源不足且在传代培养过程中极易老化与去分化^[3]，因此并不是理想的种子细胞。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有良好的自我更新能力和多向分化的潜能^[4-7]，来源广泛，经过定向诱导后能够成为一种较为理想的种子细胞。

共培养是较为有效的定向诱导BMSCs技术。目前广泛采用的共培养体系(直接接触共培养及Transwell膜分离共培养)均存在不足之处，直接接触共培养由于是将诱导细胞与干细胞直接接触培养，导致诱导成功后两种细胞分离困难，从而降低了干细胞纯度；Transwell共培养体系则过于依赖Transwell共培养板，导致无法大规模进行细胞诱导，限制了其在临床中的实际应用^[8]。

基于以上研究背景，本实验尝试采用微囊体系进行细胞共培养研究，以期克服现有共培养技术的缺陷。微囊是利用人工合成或者天然的高分子材料经过静电黏附、沉淀等工艺合成的一类囊状物，可以用来包裹药物、细胞、生物活性物质等，其直径为1-500 μm。微囊的外膜为一层半透膜，能够允许营养物质、细胞因子等进入，能阻止免疫大分子出囊。已有研究表明微囊在制作药物缓释剂、细胞冻存等方面有良好的效果。

常用的微囊材料分为天然高分子材料和人工合成高分子材料。海藻酸盐、壳聚糖、阿拉伯胶、琼脂等属于天然高分子材料，聚酰胺、硅胶、丙交酯-乙基纤维素、聚碳酯等则属于人工合成高分子材料。目前应用最为成熟的微囊是Lim等^[9]于1980年发明的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊(alginate-polylysine-alginate，APA)，是利用静电发生器将海藻酸钠-细胞悬液滴入氯化钙溶液中形成凝胶微球，然后浸于多聚赖氨酸溶液、海藻酸钠溶液、柠檬酸钠溶液中，最后以生理盐水洗去凝胶制得。制得的微囊，其内部为液态，细胞悬浮于其中，外膜为多聚赖氨酸与海藻酸反应而成的半透膜。通过调节静电发生器的电压和海藻酸钠溶液的浓度可以控制微囊的大小。

由于微囊良好的生物相容性、免疫隔离性及半透性，在其诞生之日起就被认为在细胞工程领域有着广泛的应用前景。De Vos等^[10]将APA微囊移植入大鼠体内，2年后无任何不良反应，并且发现微囊的免疫隔离作用可维持200 d左右。Yoshioka等^[11]的研究证实微囊壁可阻止相对分子质量在16万左右的抗体及免疫大分子进出细胞，不会影响囊内细胞营养供应及其细胞因子的出囊。这些特性都表明微囊是一种非常理想的细胞工程学载体及细胞支架。

就目前的研究成果来看，近年来微囊的应用研究主要集中于细胞冻存和细胞移植两个方面。在细胞移植用于疾病治疗方面，Lim等^[9]发现将微囊化异种胰岛细胞移植入大鼠体内，可明显延长移植细胞的存活时间。此后学者们先后在兔、犬及灵长类动物体内进行微囊化异种胰岛细胞移植治疗糖尿病研究，均获得了成功。此外，在移植甲状旁腺细胞^[12]、肝细胞^[13]、嗜铬细胞的研究中也取得了显著成果^[14]。在细胞冻存方面，Inaba等^[15]将胰岛β细胞用微囊包裹后按常规方法冻存，4周后复苏，发现其合成胰岛素功能未受影响。Hang等^[16]将人肝细胞微囊化后放入由80%DMEM、体积分数10%胎牛血清和10%二甲基亚砜组成的冻存液中进行冻存，对照组为非微囊化的人肝细胞，1周后复苏，发现微囊化组细胞合成蛋白、尿素的水平均远远高于未微囊化组。

作者设想微囊共培养体系可以克服接触性培养中干细胞纯度降低和Transwell非接触共培养体系中细胞增殖缓慢的缺点，为干细胞的定向诱导提供新思路，同时为人工耳郭种子细胞制备提供更广泛的技术选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机分组设计，对照实验。

时间及地点：实验于2014年1至5月在西安交通大学医学院实验动物中心完成。

材料：

实验动物：2月龄雄性新西兰大耳兔6只，体质量1.5-2.5 kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(陕)2014-003，其中3只用于BMSCs的提取，另3只用兔软骨细胞的提取。

实验方法：

兔BMSCs的分离与培养：采用全骨髓密度梯度离心法合并贴壁培养法分离培养兔BMSCs^[17]。取兔股骨，PBS洗去附着血迹，切除其两端干骺端，暴露骨髓腔。用含有 100 U/L肝素的生理盐水反复冲洗骨髓腔，将收集到的冲洗液用DMEM/F12培养基稀释后，以等体积比缓慢注入装有Percoll分离液的离心管中，2 000 r/min离心30 min，离心半径9 cm。吸取单核细胞层加入DMEM/F12培养液中， 1 200 r/min离心10 min，离心半径9 cm，反复2次。用含有体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，接种于 25 cm²细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的孵育箱中进行原代培养。每隔48 h换液，待原代细胞长至80%融合后，按1∶3比例传代培养。

在光学显微镜下分别对原代、2代及3代BMSCs进行形态学观察；对3代BMSCs进行苏木精-伊红染色，选取CD34、CD44、CD45及CD105四种表面标记物进行流式细胞术鉴定。

兔软骨细胞的分离与培养：根据Craft等^[18]的方法提取兔软骨细胞。空气栓塞法处死新西兰大耳兔，无菌环境中取出其双膝关节软骨，剪碎成1-3 mm²大小，置于无菌离心管中，以PBS冲洗3次，1 000 r/min离心3 min，离心半径9 cm，吸去PBS，加入0.25%胰酶5 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的孵育箱中30 min，小心吸出胰酶，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶5 mL，置于孵育箱中消化 6 h。收集消化液，800 r/min离心3 min，离心半径9 cm，弃上清。加入DMEM/F12重悬，800 r/min离心3 min，重复2次。加入5 mL含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的孵育箱中进行原代培养。每隔48h换液，待原代细胞长至80%融合后，按1∶3比例传代培养。取第2代细胞进行微囊化处理。

软骨细胞的微囊化：取第2代兔软骨细胞，0.25%胰酶消化并收集后，使用APA微囊发生器依如下步骤制备微囊化软骨细胞：将软骨细胞与1.5%海藻酸钠溶液混合，调整细胞浓度为5×10⁹ L^-¹，将该细胞悬液经无菌注射器泵滴入100 mmol/L CaCl₂溶液中钙化20 min，得到海藻酸钙凝胶珠。将该胶珠与0.05%多聚赖氨酸反应成膜，轻微振荡 15 min形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜。PBS洗涤，以55 mmol/L的柠檬酸钠液化5 min，PBS洗涤，0.15%海藻酸钠溶液反应5 min，PBS洗涤，得到APA微囊化的软骨细胞。制得的微囊直径约为400 μm。制备微囊所需溶液均经过滤菌。按体积比(微囊∶培养液)1∶10加入含有体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的孵育箱中孵育24 h，进行下游实验。

微囊化软骨细胞的计数：取1 mL微囊悬液，以1 mL无菌注射器反复抽吸，直至镜下观察大多数微囊已破，再以200目筛网过滤以除去微囊碎片，离心后重悬，再以细胞计数板计数，所得细胞数与总体积之比即为软骨细胞的密度。

实验分组：①实验组：将BMSCs按5×10⁴/孔种于Transwell小室的下板，12 h后将微囊化软骨细胞悬液按5×10⁴/孔加入Transwell小室中。每个小室中共计1×10⁵个细胞，软骨细胞与BMSCs比例为1∶1。②对照组：为传统Transwell共培养组(以下简称传统共培养组)及纯干细胞组。传统共培养组中将BMSCs按5×10⁴/孔种于Transwell小室的下板，12 h后在上板接种相同数量的软骨细胞，将上下板共通以实现共培养。纯干细胞组中将BMSCs按5×10⁴/孔种于Transwell小室的下板。

主要观察指标：

MTT法检测干细胞增殖率：于共培养的1，4，7 d后，每组各取10孔细胞，弃去微囊或软骨细胞，加入MTT 20 μL/孔，培养6 h，然后加入DMSO 150 μL/孔，振荡 10 min，酶联检测仪上以波长492 nm测量吸光度值，每组以10孔的平均值为最终结果。

为消除软骨细胞对检测结果的影响，保证检测结果的真实有效性，甲苯胺蓝染色、番红花O染色、糖胺聚糖检测及Ⅱ型胶原蛋白定量检测前均经过如下处理：共培养7 d后，弃去软骨细胞或微囊，PBS小心冲洗下板2次，加培养液继续培养干细胞5 d，后按常规检测方法进行。

甲苯胺蓝染色：吸去培养液，以PBS冲洗2次，加入甲苯胺蓝染液染色10 min，吸去染液，PBS冲洗2次，常规脱水干燥，透明封固封后显微镜下观察。

番红花O染色：吸去培养液，PBS冲洗2次，酸性乙醇分化15 s，PBS冲洗，苏木精染色3 min，PBS冲洗，孔雀绿溶液染色3 min，1%醋酸快速漂洗，0.1%的番红花O水溶液染色3 min。常规脱水干燥，透明固封后显微镜下观察。

糖胺聚糖检测：吸去培养液，胰酶消化3 min，调整每孔细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，加入裂解液，4 ℃下裂解30 min，以硫酸骨素为标准品，紫外分光光度计制作标准曲线，阿利新蓝法检测上清液中糖胺聚糖水平。每组取10孔细胞，以10孔平均值作为最终结果。

Elisa法定量测量干细胞合成Ⅱ型胶原蛋白的能力：收集细胞培养液，-70 ℃下保存备用。检测时置于4 ℃过夜解冻，在Elisa试剂盒中每孔各加入标准品或待测品 100 μL，充分混匀后置37 ℃中120 min，洗板，加一抗工作液100 μL，混匀后置37 ℃中60 min，洗板，加酶标抗体工作液100 μL，混匀后置37 ℃中30 min，洗板，加底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min，加终止液混匀，30 min内用酶标仪于450 nm处测吸光度值，并按以下公式计算Ⅱ型胶原蛋白含量：

统计学分析：数据结果采用x(_)±s的形式表示。应用SPSS 16.0软件对所有数据进行统计学处理。多组间差异采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

讨论

耳郭的修复重建一直是耳科的研究难点之一，主要由于耳郭表面形态复杂且耳软骨的缺损无法得到有效修复。近年来组织工程的发展为解决这一问题提供了新的理论和技术手段。其核心技术是建立有效的细胞-支架复合物，以使其能够实现精确的耳郭再造^[19]。其中种子细胞的选择十分重要，传统的软骨细胞(肋软骨、膝关节软骨等)来源不足，且极易老化与去分化，因此并不是理想的种子细胞。如何能够得到活性良好且功能接近软骨细胞的种子细胞，是本实验的主要目的。

BMSCs因其具有多向分化的潜能而常被用于组织工程的种子细胞^[20]。通过定向诱导可以使BMSCs向成骨、成软骨、成脂、成神经等方向定向分化。目前诱导BMSCs定向分化的主要技术有3种，分别是条件诱导法^[21]、诱导细胞与BMSCs直接接触共培养法^[22]、Transwell膜非接触共培养诱导法^[23]。然而大量实验证实，上述3种方法分别存在如下问题：条件培养法中添加的化学试剂具有一定的毒性，且会导致BMSCs发生变异，临床应用具有一定的风险；直接接触共培养法将诱导细胞与BMSCs放在一个体系中共培养，导致两种细胞难以分离，从而降低了BMSCs的纯度，增加了临床应用的难度；Transwell虽然实现了在分离两种细胞的同时对BMSCs的诱导，但由于Transwell设备基于24孔或6孔板，无法大规模培养，导致难以应用于临床。对于软骨细胞与BMSCs共培养体系而言，由于此两种细胞的增殖速度不同，增殖较快的软骨细胞消耗了培养液中的大量养分，导致BMSCs无法良好增殖。

本实验中所采用的微囊是一种人工合成的高分子囊性物质，自20世纪70年代被发明以来，至今已有许多学者做过深入研究。微囊的价值主要在于其表面的一层半透膜上。以出现最早，研究最为深入的APA微囊为例^[24]，其内部是液态的海藻酸钠溶液，可为细胞生长提供稳定的生长环境，外部是一层高分子半透膜，可以使营养物质、细胞因子等自由通过。目前关于微囊的研究主要集中于细胞冻存、药物缓释剂的制备及细胞移植上，用于细胞共培养的研究较少。事实上微囊的半透膜正是一种理想的共培养设备，由于其不受Transwell孔板的限制，成本相对比较低廉，可以满足大规模诱导细胞的需求，且由于微囊的免疫隔离作用，为今后科学研究或临床应用中同种异体细胞诱导或异种细胞诱导提供了技术保证。

微囊的大小可通过微囊发生器参数、组分溶液浓度、钙化时间等进行调节。微囊的直径可决定其内部空间及囊壁孔隙率的大小，进而决定其性能。本实验中所采用的微囊直径约为400 μm^[25]。这是由于已有文献证实，直径为400 μm左右的微囊能够允许营养物质及细胞因子自由通过，而阻止相对分子质量大于16万的免疫大分子及细胞出囊。若微囊直径过小(< 200 μm)则不利于其内部的细胞生长，若直径过大(> 600 μm)则会造成微囊壁机械强度下降，导致破囊率上升。

本实验结果证实了微囊诱导体系可以在不影响细胞增殖的前提下，表现出比传统Transwell体系更高的诱导效率。作者认为，相比Transwell体系，微囊诱导体系主要存在以下4个优势：微囊壁的半透性可使软骨细胞分泌的多种诱导因子通过囊壁作用于外部的BMSCs，同时又能阻止大分子免疫球蛋白通过，实现了软骨细胞与BMSCs的免疫隔离，降低了细胞增殖过程中所受到的毒性，提高了安全性^[26]；微囊可以使其内的软骨细胞形成局部密集生长^[27]，在局部形成高密度的诱导因子，增加囊壁两侧的压力差，更有利于诱导因子出囊并实现对BMSCs的诱导；由于囊壁的压力限制了软骨细胞的增殖速度，降低了软骨细胞对养分的消耗^[28]，从而使BMSCs能获得更多的养分；微囊化共培养体系不依赖于Transwell膜，可以应用于普通培养瓶等大规模的培养方式，更有利于临床应用^[29]。

就共培养诱导领域而言，理想的微囊应具备以下几个特点^[30]：良好的组织相容性和尽可能低的细胞毒性，不应对细胞生长产生负面影响；稳定的化学性质，在诱导过程中微囊能够不被培养液所溶解或发生成分改变；良好的半透性，可以允许细胞因子和营养物质通过，不允许细胞及免疫大分子通过；有一定的强度，即尽可能低的破囊率；均匀的表面结构，其半透膜表面的微孔应大小均匀。目前的技术已经能够制备组织相容性良好、化学性质稳定、结构均匀且半透性良好的微囊，唯有破囊率这一难题一直未能得到有效解决。这是由于微囊发生器操作复杂，部分实验人员操作不熟练，再加上设备本身的机械误差所致。破囊会导致部分诱导细胞混入干细胞中，从而降低种子细胞纯度，这一难题仍有待于对微囊技术的深入研究和微囊设备的改进。本实验证实，微囊化的软骨细胞能够成功诱导BMSCs向成软骨方向定向分化，同时不影响BMSCs的纯度和增殖，且诱导效果优于传统的Transwell膜分离共培养法。微囊化共培养体系提供了一种安全有效的体外BMSCs诱导方法，也为其他组织工程化组织的体外培养提供了技术参考。在接下来的研究中，将分析本实验中微囊式定向分化BMSCs在细胞支架中的生长情况，评估其作为人工耳郭种子细胞的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：

微囊化软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞的体外定向分化

The inductive effect of microcapsuled chondrocytes cocultured with bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[2]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[3]	徐聪, 赵赫, 孙岩. 生物材料导管修复面神经损伤与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1089-1095.
[4]	陈世崧, 刘晓红, 徐志云. 人工生物瓣膜的研究现状及展望[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1096-1102.
[5]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[6]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[7]	李启程, 邓进, 付小洋, 韩娜. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 853-859.
[8]	王敏, 尹秀山, 王盈熹, 张妍, 赵龙, 夏书月. 吸入骨髓间充质干细胞来源外泌体减轻慢性阻塞性肺疾病的炎性损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 827-834.
[9]	许其静, 杨伊春, 雷微, 杨莹, 余江, 夏婷婷, 张萌, 章涛, 张潜. 糖尿病皮肤慢性创面无细胞治疗的进展与问题[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 962-969.
[10]	张辉, 王佳洋, 王茜, 甘洪全, 王志强. 动态培养环境下透明质酸与国产多孔钽复合对软骨细胞功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 339-345.
[11]	刘欢, 李涵, 马云豪, 仲维剑, 马国武. 部分脱矿牙本质颗粒在上颌窦提升中的成骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 354-359.
[12]	李睿, 刘珍, 郭子歌, 卢瑞杰, 王晨. 纯钛表面载阿司匹林微球与聚多巴胺复合涂层促进成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 374-379.
[13]	蒋海芳, 刘融, 胡鹏, 陈伟, 魏在荣, 杨成兰, 聂开瑜. 3D打印技术在唇腭裂精准与个性化治疗中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 413-419.
[14]	王子扬, 左恩俊. 生物材料在活髓保存中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 427-433.
[15]	孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3293-3299.